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Nf04_2014 - Gottschalk, Alexander

Flash &Freeze Elektronenmikroskopie zur zeitaufgelösten Analyse der synaptischen Ultrastruktur nach optogenetischer Stimulation. A) Schema des Experiments für langsame, durch extreme Aktivität hervorgerufene Prozesse. Tiere die ChR2 in cholinergen Neuronen exprimieren, werden für 30 s photostimuliert. Zu definierten Zeitpunkten nach Ende des Lichtstimulus (blauer Balken) werden die Tiere durch Hochdruckgefrieren in < 10 ms ultratiefgefroren und synaptische Strukturen fixiert. Diese werden in Folge durch Gefriersubstitution präpariert, mit Schwermetallionen angefärbt und in Dünnschnitten per Elektronenmikroskopie analysiert. Wird eine langsame Variante von ChR2 benutzt (die Mutation C128S führt zu einer anhaltenden Öffnung des Kanals bei kurzer Photostimulation; Schultheis et al. (2011)), so kann man die Tiere auch während der Stimulation der Zellen einfrieren. B) Experiment für die Analyse ultraschneller Vorgänge. Eine Variante von ChR2, ChIEF wird verwendet, welche sehr schnell schließt und somit eine sehr akzentuierte Depolarisation erlaubt. Das Experiment findet in einem Hochdruckgefrierer statt, bei dem Licht in die Gefrierkammer geleitet werden kann, so daß die Tiere bereits 20 ms nach dem Lichtstimulus fixiert werden können. C) Dünnschnitt (40 nm) Transmissionselektronenmikroskopie von cholinergen Synapsen. Oben: unstimuliert, unten nach 30 s Photostimulation. An die Plasmamembran gedockte synaptische Vesikel sind depletiert, und es haben sich große endozytotische Vesikel („100 nm Vesikel“) ausgebildet. Die Aufnahmen wurden von Szi-chiehYu zur Verfügung gestellt.

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