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Nf02_2004 - Wouters, Fred S.

Oberes Feld: FLIM-Messung an einem einfachen zellularen Testsystem. HeLa-Zellen wurden mit einem nuklear lokalisierenden Cyan-Fluoreszenzprotein und einem Cyan-Gelb-Fusionsprotein transfiziert. Das letzte Konstrukt zeigt effizientes FRET zwischen dem Cyan-Donor und dem gelben Akzeptor. Im gemessenen Cyan-optimierten Wellenlängebereich sind beide Konstrukte spektral identisch (siehe Cyan-Emission, linkes Bild), weisen aber klare Lebensdauerunterschiede auf (mittleres Bild). Die Lebensdauern sind in Falschfarben kodiert (siehe Farbstreifen), wobei wärmere Farben kürzere Lebensdauer (mehr FRET), und kältere Farben längere Lebensdauer (weniger FRET) wiedergeben. Das nuklear lokalisierte Einzel-Cyan-Fluoreszenzprotein zeichnet sich durch eine höhere Lebensdauer als das umringende Zytoplasma aus. Dieses deutet auf die Anwesenheit von FRET hin, d.h. auf das RETtende Cyan-Gelb-Fusionsfluoreszenzprotein im letzteren Kompartiment. Beide Konstrukte können anhand ihrer Lebensdauer getrennt werden, wenn ein Lebensdauerschwellenwert von 2 Nanosekunden gewählt wird (rechtes Bild). Die Gebiete mit einer Lebensdauer über 2 Nanosekunden sind grün dargestellt und zeigen die Nuklei. Die Gebiete mit einer Lebensdauer unter 2 Nanosekunden sind rot dargestellt und zeigen den Rest der Zelle. Unteres Feld: FLIM-Messung an humanen SH-SY5Y Neuroblastoma-Zellen, die mit einem GPI-modifizierten grünen Fluoreszenzprotein transfiziert wurden. Diese Modifikation mediiert die Proteinlokalisation in Membrangebieten, die bekannt sind als „lipid rafts“. Das Fluoreszenzprotein ist in der äußeren Membranschicht lokalisiert, wo es mit anderen „lipid rafts“ sich mischen kann. Als zweite Komponente der „lipid rafts“ wurde das Gangliosid G1-Lipid ausgewählt, dass sich detektieren lässt per Inkubation mit einem gelabelten (Alexa 549) bakteriellen Toxin, dem Cholera-Toxin beta-Untereinheit. Gezeigt wird die Donor-Fluoreszenz des GPI-Fluoreszenzproteins (linkes Bild), deren Lebensdauern in der Zelle (mittleres Bild), und die Segmentierung in FRETtenden und nicht- FRETtenden Zellgebieten. Die Mischung der „lipid rafts“ kann anhand von FRET zwischen dem GPI-Fluoreszentprotein und dem Alexa- Farbstoff in bestimmten Regionen der Plasmamembran nachgewiesen werden. Das Cholera-Toxin zeigt eine gleichmäßige Verteilung auf der Zelle (nicht angezeigt). Dieses demonstriert, dass FRET eine Auflösung hat, die über die optische Auflösung (weit) hinaus geht. Die FLIM-Messungen wurden ausgeführt auf einem Leica SP2-Konfokalem Mikroskop mit Zwei-Photonen-Anregung im Femtosekunden-Puls-Modus (Coherent Mira 900) bei einer Zwei-Photonen-Wellenlänge von 820 Nanometer für die Anregung des Cyan-Fluoreszensproteins und 900 Nanometer für das Grün-Fluoreszenzprotein.

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