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Nf03_2009 - Rizzoli, Silvio

Abb. 3: Darstellung der Vesikelmarkierung durch Styrylfarbstoffe und flureszenzmarkierte Antikörper. (A) In der Synapse lagernde Vesikel (1) können mit Styrylfarbstoffen (z.B. FM1-43, FM4-64) aktivitätsabhängig markiert werden. Durch die Inkubation der Präparation mit Styrylfarbstoff (grüner Hintergrund) lagert sich dieser mit den lipophilen Enden an die äußere Zellmembran (2). Während der Stimulierung fusionieren die synaptischen Vesikel mit der Zellmembran (3). Bei der anschließenden Endozytose wird der Farbstoff durch die neu geformten Vesikel aufgenommen; der Farbstoff ist an die innere Vesikelmembran gebunden (4). Ein anschließender Waschschritt entfernt den Styrylfarbstoff wieder aus dem extrazellulären Bereich (5). Durch erneute Stimulierung können die markierten Vesikel den Farbstoff während der Exozytose wieder verlieren (Wegwaschen des membrangebundenen Styrylfarbstoffs) (6). (B) Die Markierung synaptischer Vesikel mit Antikörpern erfolgt in folgender Weise: Das synaptische Vesikelprotein Synaptotagmin ist ein Transmembranprotein mit einer extravesikulären Domäne mit zwei C2-Motiven und einer intravesikulären Domäne (1). Nach der Exozytose befindet sich die lumenale Domäne außerhalb der Präsynapse (2). Ein flureszenzmarkierter Antikörper, der gegen die intravesikuläre Domäne des Synaptotagminproteins gerichtet ist (Cy3-Sytlum-AB), kann in diesem Stadium des Vesikelkreislaufs an sein Epitop binden (3). Beim Recycling des Vesikels wird der gebundene Antikörper mit dem neu geformten Vesikel in die Synapse aufgenommen (4). Es werden dabei nur Vesikel markiert, die während der Antikörperinkubation den Exo-, Endozytoseweg durchlaufen. Der Vorteil dieser Vesikelmarkierung liegt darin, dass bei einer anschließenden Stimulierung der Antikörper mit dem Protein verbunden bleibt und nicht wie die Styrylfarbstoffe bei der Exozytose verloren geht.

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